Trimethoprim hemmt das Enzym Dihydrofolatreduktase, das an der Umwandlung von Folsäure in Folinsäure (Tetrahydrofolsäure) beteiligt ist. Die Hemmung des Enzyms ist bei Bakterien 50000-mal stärker als beim Menschen, so dass Trimethoprim relativ sicher ist, auch wenn es bei längerem Gebrauch in voller Dosis die Blutbildung beeinträchtigen kann.
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