Bei einem konfokalen Rastermikroskop wird ein Laserstrahl mit sehr geringer Tiefenschärfe verwendet. Der hohe Konvergenzgrad der Laserstrahlung ermöglicht es, sehr kleine Schnitte - im Idealfall 1 Mikrometer - durch eine einzelne Zelle anzusteuern. Der einfallende Strahl wird von der Zelle, die oft mit fluoreszierenden Verbindungen markiert ist, teilweise absorbiert, und das durchgelassene Licht wird von einem Photomultiplier erfasst.
Mit Hilfe einer Computeranalyse kann aus dem Signal des Photomultipliers bei unterschiedlicher Tiefe ein 3D-Bild der Zelle rekonstruiert werden.
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