Le diagnostic peut être suspecté sur la base des résultats cliniques et est fermement établi par :
- une biopsie rectale, généralement réalisée sous anesthésie, sous forme de biopsie à l'emporte-pièce ou par aspiration. Une biopsie positive documente l'absence de cellules ganglionnaires, ce qui peut être confirmé par une coloration de l'acétylcholinestérase.
- manométrie anorectale : la distension rectale démontre l'absence du réflexe inhibiteur rectoanal normal
- lavement baryté : montre un rectum non dilaté, une zone transitoire étroite et un intestin proximal très dilaté.
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