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Le triméthoprime inhibe l'enzyme dihydrofolate réductase qui intervient dans la conversion de l'acide folique en acide folinique (tétrahydrofolique). L'inhibition de l'enzyme est 50000 fois plus importante chez les bactéries que chez l'homme. Le triméthoprime est donc relativement sûr, bien qu'une utilisation prolongée à fortes doses puisse interférer avec l'hémopoïèse.
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