Methode voor DNA-sequentiebepaling

Handmatige methode:

• Een fragment dubbelstrengs DNA waarvan de volgorde onbekend is, wordt gekloond in een plasmide vector. Er wordt warmte toegepast om de twee strengen te scheiden. Er wordt een primer toegevoegd die vervolgens hybridiseert met een van de twee sjabloonstrengen. De DNA-primer heeft een radioactief label. De plasmide-primer hybride wordt vervolgens toegevoegd aan vier buisjes. Elk buisje bevat DNA polymerase, alle vier de nucleotiden en een enkele dideoxynucleotide (elk buisje bevat een andere dideoxynucleotide). De toevoeging van het DNA polymerase verlengt de DNA primer die nucleotiden, en soms dideoxynucleotiden, in de groeiende DNA-ketens integreert. De opname van de dideoxynucleotide voorkomt rek van de DNA-keten. De nieuw gevormde DNA-strengen worden vervolgens geanalyseerd. De DNA-strengen worden op een speciale sequentiegel geladen die het mogelijk maakt om DNA-strengen te scheiden die slechts één base verschillen. Elektroforese verdeelt de strengen vervolgens op basis van grootte, waarbij de kleinste strengen het verst langs de gel reizen. De lengte van de streng is belangrijk omdat dit betekent dat de kortste strengen de nucleotiden hebben opgenomen die het dichtst bij de primer liggen. De volgorde van het DNA van 5' tot 3' kan worden afgeleid uit het aflezen van het sequentiepatroon vanaf de onderkant van de gel naar boven.

Geautomatiseerde methode:

• Deze is vergelijkbaar met de handmatige methode, maar maakt in plaats daarvan gebruik van een DNA-primer die gelabeld is met vier verschillende fluorescerende tags. Het afleiden van de nucleotidesequentie berust op de emissie van een specifiek fluorescerend signaal van elk fragment. De golflengte van elk signaal komt overeen met een dideoxynucleotide dat in de elongatiereactie is opgenomen. Computeranalyse vertaalt de signalen als een nucleotidesequentie.