El diagnóstico puede sospecharse sobre la base de los hallazgos clínicos, y se establece firmemente mediante:
- la biopsia rectal, que suele obtenerse bajo anestesia en forma de biopsia en sacabocados o por succión. Una biopsia positiva documentará la ausencia de células ganglionares; esto puede confirmarse mediante tinción para acetilcolinesterasa
- manometría anorrectal: la distensión rectal demuestra la ausencia del reflejo inhibitorio rectoanal normal
- enema opaco: muestra un recto no dilatado, una zona de transición estrecha y un intestino proximal muy dilatado.
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