Método de secuenciación del ADN

Método manual:

• un fragmento de ADN de doble cadena cuya secuencia se desconoce se clona en un vector plasmídico. Se aplica calor para separar las dos cadenas. Se añade un cebador que se hibrida con una de las dos cadenas molde. El cebador de ADN tiene una etiqueta radiactiva. El híbrido plásmido-primer se añade a cuatro tubos. Cada tubo contiene ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos y un único dideoxinucleótido (cada tubo contiene un dideoxinucleótido diferente). La adición de la ADN polimerasa extiende el cebador de ADN que incorpora nucleótidos y, ocasionalmente, dideoxinucleótidos a las cadenas de ADN en crecimiento. La incorporación del dideoxinucleótido impide la elongación de la cadena de ADN. A continuación, se analizan las cadenas de ADN recién formadas. Las cadenas de ADN se cargan en un gel de secuenciación especial que permite separar las cadenas de ADN que sólo difieren en una base. A continuación, la electroforesis distribuye las cadenas en función de su tamaño, y las más pequeñas son las que se desplazan más lejos a lo largo del gel. La longitud de la cadena es importante porque significa que las cadenas más cortas han incorporado los nucleótidos más cercanos al cebador. La secuencia del ADN de 5' a 3' puede deducirse de la lectura del patrón de secuenciación desde la parte inferior del gel hacia arriba.

Método automatizado:

• Es similar al método manual, pero utiliza un cebador de ADN marcado con cuatro etiquetas fluorescentes diferentes. El proceso de deducción de la secuencia de nucleótidos se basa en la emisión de una señal fluorescente específica de cada fragmento. La longitud de onda de cada señal corresponde a un dideoxinucleótido incorporado en la reacción de elongación. El análisis informatizado traduce las señales en una secuencia de nucleótidos.