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La phosphorylation oxydative est le moyen hypothétique par lequel l'ATP est généré à partir du phosphate inorganique et de l'ADP dans les mitochondries. Elle est étroitement liée au passage d'électrons à haute énergie dans la chaîne de transfert d'électrons.
L'hypothèse la plus plausible pour relier la production d'ATP par l'enzyme ATP synthase aux réactions de la chaîne de transfert d'électrons est celle de la chimiosmose :
La phosphorylation oxydative dépend du cycle de l'acide tricarboxylique et, dans une moindre mesure, de voies telles que la glycolyse, pour fournir une "force motrice" en termes de NADH et de FADH2 à la chaîne de transport d'électrons. Inversement, lorsque les réserves de NADH et de FADH2 sont faibles, l'hydrolyse de l'ATP par l'ATP synthase peut être couplée pour les produire par la chaîne de transport d'électrons fonctionnant en sens inverse. Ceci est facilité par le fait que toutes les enzymes de la chaîne de transport d'électrons sont proches de l'équilibre.
En outre, le découplage de l'ATP synthase et de la chaîne de transport d'électrons se produit dans la graisse brune. Le gradient de protons est utilisé pour créer de la chaleur plutôt que de l'ATP.
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