Méthode de séquençage de l'ADN

Méthode manuelle :

• un fragment d'ADN double brin dont la séquence est inconnue est cloné dans un vecteur plasmidique. La chaleur est appliquée pour séparer les deux brins. Une amorce est ajoutée, qui s'hybride ensuite à l'un des deux brins modèles. L'amorce d'ADN comporte une étiquette radioactive. L'hybride plasmide-amorce est ensuite ajouté à quatre tubes. Chaque tube contient de l'ADN polymérase, les quatre nucléotides et un seul didésoxynucléotide (chaque tube contient un didésoxynucléotide différent). L'ajout de l'ADN polymérase étend l'amorce d'ADN qui incorpore les nucléotides, et parfois les didésoxynucléotides, dans les chaînes d'ADN en croissance. L'incorporation du didésoxynucléotide empêche l'élongation de la chaîne d'ADN. Les brins d'ADN nouvellement formés sont ensuite analysés. Les brins d'ADN sont chargés sur un gel de séquençage spécial qui permet de séparer les brins d'ADN ne différant que par une base. L'électrophorèse répartit ensuite les brins en fonction de leur taille, les plus petits se déplaçant le plus loin sur le gel. La longueur du brin est importante car elle signifie que les brins les plus courts ont incorporé les nucléotides les plus proches de l'amorce. La séquence de l'ADN de 5' à 3' peut être déduite de la lecture du schéma de séquençage à partir du bas du gel.

Méthode automatisée :

• Cette méthode est similaire à la méthode manuelle, mais elle utilise une amorce d'ADN étiquetée avec quatre marqueurs fluorescents différents. Le processus de déduction de la séquence nucléotidique repose sur l'émission d'un signal fluorescent spécifique pour chaque fragment. La longueur d'onde de chaque signal correspond à un didésoxynucléotide incorporé dans la réaction d'élongation. L'analyse informatisée traduit les signaux en séquence nucléotidique.