O diagnóstico pode ser suspeitado com base nos achados clínicos e é firmemente estabelecido por:
- biópsia rectal, que é normalmente obtida sob anestesia, sob a forma de biópsia por punção ou sucção. Uma biópsia positiva documentará a ausência de células ganglionares; este facto pode ser confirmado pela coloração para a acetilcolinesterase
- manometria anorrectal: a distensão rectal demonstra uma ausência do reflexo inibitório reto-anal normal
- enema de bário: mostra um reto não dilatado, uma zona de transição estreita e um intestino proximal muito dilatado.
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