Quando o esfíncter de Oddi está tonicamente contraído entre as refeições, a bílis não pode fluir para o duodeno e, em vez disso, passa para a vesícula biliar para armazenamento. A pressão do esfíncter é tipicamente de 15 mmHg em repouso, mas aumenta para mais de 100 mmHg várias vezes por minuto de forma cíclica; na ausência de estimulação para relaxamento, isto excede a pressão média de repouso de 10 mmHg na vesícula biliar.
Durante o armazenamento, a composição da bílis é ainda mais modificada. Os iões de sódio passam por um gradiente de difusão para o exterior da vesícula biliar, acompanhados de água e cloreto ou bicarbonato. A bílis deixada para trás tem um volume menor, mas uma concentração maior.
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