Methode der DNA-Sequenzierung

Manuelle Methode:

• Ein Fragment der doppelsträngigen DNA, deren Sequenz unbekannt ist, wird in einen Plasmidvektor kloniert. Zur Trennung der beiden Stränge wird Hitze eingesetzt. Es wird ein Primer hinzugefügt, der dann an einen der beiden Template-Stränge hybridisiert. Der DNA-Primer ist mit einer radioaktiven Markierung versehen. Das Plasmid-Primer-Hybrid wird dann in vier Röhrchen gegeben. Jedes Röhrchen enthält DNA-Polymerase, alle vier Nukleotide und ein einzelnes Dideoxynukleotid (jedes Röhrchen enthält ein anderes Dideoxynukleotid). Durch die Zugabe der DNA-Polymerase wird der DNA-Primer verlängert, der die Nukleotide und gelegentlich auch Dideoxynukleotide in die wachsenden DNA-Ketten einbaut. Durch den Einbau des Dideoxynukleotids wird die Verlängerung der DNA-Kette verhindert. Die neu gebildeten DNA-Stränge werden dann analysiert. Die DNA-Stränge werden auf ein spezielles Sequenziergel geladen, das die Trennung von DNA-Strängen ermöglicht, die sich nur um eine Base unterscheiden. Bei der Elektrophorese werden die Stränge dann entsprechend ihrer Größe verteilt, wobei die kleinsten Stränge am weitesten auf dem Gel wandern. Die Länge des Strangs ist wichtig, denn sie bedeutet, dass die kürzesten Stränge die Nukleotide eingebaut haben, die dem Primer am nächsten sind. Die Sequenz der DNA von 5' bis 3' kann aus dem Ablesen des Sequenzierungsmusters vom Boden des Gels aufwärts abgeleitet werden.

Automatisierte Methode:

• Diese Methode ähnelt der manuellen Methode, verwendet jedoch einen DNA-Primer, der mit vier verschiedenen fluoreszierenden Markierungen versehen ist. Der Prozess der Ableitung der Nukleotidsequenz beruht auf der Emission eines spezifischen Fluoreszenzsignals jedes Fragments. Die Wellenlänge jedes Signals entspricht einem Didesoxynukleotid, das in die Verlängerungsreaktion eingebaut wurde. Eine computergestützte Analyse übersetzt die Signale in eine Nukleotidsequenz.