Método de sequenciação de ADN

Método manual:

• um fragmento de ADN de cadeia dupla cuja sequência é desconhecida é clonado num vetor de plasmídeo. Aplica-se calor para separar as duas cadeias. Adiciona-se um iniciador que depois hibridiza com uma das duas cadeias do modelo. O iniciador de ADN tem uma etiqueta radioactiva. O híbrido plasmídeo-primer é então adicionado a quatro tubos. Cada tubo contém ADN polimerase, os quatro nucleótidos e um único didesoxinucleótido (cada tubo contém um didesoxinucleótido diferente). A adição da ADN polimerase estende o iniciador de ADN que incorpora nucleótidos e, ocasionalmente, didesoxinucleótidos em cadeias de ADN em crescimento. A incorporação do didesoxinucleótido impede o alongamento da cadeia de ADN. As cadeias de ADN recém-formadas são então analisadas. As cadeias de ADN são carregadas num gel especial de sequenciação que permite a separação das cadeias de ADN que diferem apenas numa base. A eletroforese distribui então as cadeias de acordo com o seu tamanho, sendo as mais pequenas as que se deslocam mais longe ao longo do gel. O comprimento da cadeia é importante porque significa que as cadeias mais curtas incorporaram os nucleótidos mais próximos do iniciador. A sequência do ADN de 5' a 3' pode ser deduzida a partir da leitura do padrão de sequenciação da parte inferior do gel para cima.

Método automatizado:

• Este método é semelhante ao método manual, mas utiliza um iniciador de ADN marcado com quatro etiquetas fluorescentes diferentes. O processo de dedução da sequência de nucleótidos baseia-se na emissão de um sinal fluorescente específico de cada fragmento. O comprimento de onda de cada sinal corresponde a um dideoxinucleótido incorporado na reação de alongamento. A análise computorizada traduz os sinais como uma sequência de nucleótidos.